草莓果实成熟软化相关基因的研究

【摘要】果实成熟软化的生理和分子机制是人们研究的热点问题之一。一般认为，果实软化是细胞壁降解相关酶、细胞壁修饰酶、细胞内部与物质降解有关的水解酶以及合成这些酶类的基因及调控因子等共同作用的结果。但是，不同物种的果实成熟软化过程中所发生的生理生化变化存在着差异，同类酶基因的表达丰度和时期也有很大差异。草莓（FragariaananassaDuch.）是非呼吸跃变型果实，与呼吸跃变型果实在成熟软化机制上有所不同。而且，草莓不同的栽培品种，果实质地不同，成熟过程中硬度变化和软化特性也不同。因此，需要针对具体种类的果实对成熟软化的关键酶或基因及其调控差异进行具体的研究。主要研究结果如下：1．以草莓‘丰香’（F.ananassacv.Toyonoka）果实大绿果期和转色期两个发育阶段cDNA分别为试验组（Tester）和驱动组（Driver），利用抑制差减杂交（SSH）技术构建了正反两个SSH-cDNA文库。分别挑选516和524个克隆进行测序，经序列拼接分析，共获得707条uniESTs，其中正反向文库分别为369和338个uniESTs，包括123条Contigs和584条Singletons。在Nt库比对中有537条uinESTs与已知基因匹配，占比75.95%；在Nr库比对中有505条序列有匹配蛋白，占比71.99%。有193个uniESTs能进行GO功能注释，其中细胞组分被注释了315次、分子功能被注释了332次、生物过程被注释了409次。uniESTs的功能分析显示绿果期文库多数与细胞营养生长、分裂、早期胚胎发育、营养运输有关，转色期文库主要与刺激代谢物形成、色素合成、果实软化、种子成熟有关，与草莓果实发育和成熟生理过程基本一致。采用qRT-PCR对成熟相关蛋白、PG、MYB、IRL、LEA、ETR1、ARP、WRKY、FaMADS1、FaMADS2等10个基因在草莓果实发育、成熟期及根、叶、花中的表达模式进行了分析。2．以草莓软质品种‘丰香’和硬质品种‘甜查理’（F.ananassacv.SweetCharlie）果实为试材，比较研究了二者在果实发育成熟软化过程中硬度变化与多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶裂解酶（PL）、果胶甲酯酶（PME）及纤维素酶（Cx）的活性变化；采用荧光定量PCR法检测了PG、PL、PME、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、内切葡聚糖酶（EG）基因相对表达量变化。结果如下：随着果实的发育成熟，果实硬度迅速下降，‘丰香’硬度下降更快，粉红期时其硬度值仅为‘甜查理’的54.5%。不同果实PG酶活性和基因表达变化差异较大，‘丰香’随着果实的成熟PG酶活性逐渐上升，至粉红期达到峰值，采后软化过程中PG酶活性维持在较高水平，PG基因表达变化趋势与PG酶活性变化趋势一致；而‘甜查理’果实在发育初期就能检测到PG酶活性，至白果期达到峰值，在果实成熟过程逐渐下降，一直维持在较低的水平至果实完全软化，PG基因表达变化趋势与PG酶活性变化趋势并不一致。建立了草莓果实PL酶活性测定方法，PL酶提取液确定为0.02mol·L-1Na-Pi缓冲液附加0.02mol·L-1Cysteine-HCl和1%TritonX-100，PL酶活性测定时取500nm测定其吸光值；Ca2+对PL酶活性测定吸光值没有显著影响。在果实发育阶段PL酶活性处于低水平，而成熟软化阶段PL酶活性一直维持在较高水平；PL基因表达变化趋势与PL酶活性变化趋势基本一致，而与果实硬度变化趋势相反，表明草莓PL酶与果实果胶降解成熟软化密切相关。在整个成熟软化过程中，‘丰香’果实PME酶活性始终高于‘甜查理’；而二者PME基因表达模式存在差异，‘丰香’果实PME基因表达量随着果实成熟迅速下降，而‘甜查理’果实PME基因表达量在大绿果期迅速上升，随后伴随着果实成熟其表达量快速下降。随着果实成熟，Cx活性不断升高，‘丰香’Cx活性明显高于‘甜查理’，采后‘甜查理’Cx活性迅速下降，而‘丰香’却表现上升，表明同一种类不同硬度类型的果实软化中纤维素酶所起的作用可能不同；丰香’果实在成熟软化阶段EG基因表达量高于‘甜查理’果实。3．以构建的SSH文库获得的EST序列为参考序列，利用RT-PCR和RACE技术分别从2个草莓品种粉红期果实中克隆了PG、PL、β-Gal、EG等基因的cDNA全长。序列分析结果表明：2个PG基因ORF区有5个核苷酸变异位点，导致2个氨基酸突变。‘丰香’PL与‘甜查理’PL相比多编码7个氨基酸，PL酶蛋白的C末端变异较大，表现为种类（品种）多态性。从‘丰香’草莓果实中分离的β-gal为β-Gal基因家族的一个新成员，属于糖基水解酶的35家族（Glycosidehydrolasefamily35）成员，包含保守基序“GGPIILSQIENEY”和一个半乳糖结合的凝集素结构域。2个品种β-gal表达模式趋于相同，表现为在果实成熟过程中表达量快速上升，果实粉红期达到峰值，在完全成熟的红果期表现下降。上述基因序列差异是否与果实成熟软化快慢相关有待进一步分析。4．对森林草莓（F．vesca）全基因组MADS-box转录因子基因进行了鉴定。利用生物信息学方法搜索森林草莓基因组数据库中MADS-box基因家族，分析了MADS-box基因的数量、结构类型、序列特征及染色体定位，为MADS-box基因的功能鉴定特别是在果实发育成熟过程中的作用分析提供依据。根据草莓果实FaMADS1基因序列构建了2个siRNA植物表达载体，旨在为进一步研究FaMADS1调控草莓果实发育和成熟的功能奠定基础。5．利用根癌农杆菌介导的遗传转化法建立了‘丰香’草莓离体叶片的遗传转化体系。结果表明：40mg/LKm作为转化植株的筛选浓度，200mg/LCef作为抑制农杆菌生长的浓度；预培养0～2d、农杆菌侵染时间3～5min、共培养72h和添加25～100μmol/LAS。经Km筛选和PCR检测证明得到了转基因植株。建立了桃砧木‘Nemaguard’（Prunuspersica×P.davidiana）和李砧木‘Marianna’（P.cerasifera×P.munsoniana）离体叶片不定芽再生体系，研究了激素组合、基本培养基种类、外植体类型、暗培养和琼脂等对不定芽再生的影响。结果如下，桃砧木‘Nemaguard’叶片离体不定芽再生程序为：取植株顶端第1片未完全展开的带叶柄的叶片为外植体，置于1/2MS+2.0mg/LTDZ+0.1mg/LIBA+0.25%琼脂的培养基上暗培养3周，然后转移新鲜培养基上置于16h光周期下培养，最高再生率和再生不定芽数分别为71.7%和5.74±3.24个。再生不定芽置于1/2MS+0.1~1.5mg/LIBA+3%蔗糖+0.5%琼脂的生根培养基培养，生根率为98.3~100%，根诱导培养4周后炼苗移栽。而对李砧木‘Marianna’而言，1/2MS基本培养基和WPM培养基再生率显著高于MS和SH培养基；叶片附带叶柄的外植体再生率和再生不定芽数显著高于叶柄和切除叶柄的叶片外植体；最佳再生培养基为1/2MS+2.0mg/LTDZ+0.1mg/LIBA+0.25%琼脂+3.0%蔗糖，最高再生率和再生不定芽数分别为81.7%和7.46±1.38个；最佳生根培养基为1/2MS+0.5～1.0mg/LIBA，能获得96.7%生根率、较高的生根数和根长。
【作者】周厚成；
【导师】郭蔼光；
【作者基本信息】西北农林科技大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】草莓；果实；抑制差减杂交；酶活性；基因克隆与表达；成熟软化；

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